L’element nitrogen, el símbol químic del qual és la N, és present tant al raïm com al most i al vi. L’origen dels compostos que presenten nitrogen en la composició és molt divers i està relacionat tant amb fonts de tipus orgànic com inorgànic. Les principals formes químiques presents al most són els aminoàcids, els pèptids, les proteïnes i l’ió amoni. Altres compostos químics nitrogenats de menor importància inclouen els nitrats, els nitrits, els nucleòtids, les vitamines, les amines i les amides. A la Taula 1, es mostren resultats orientatius obtinguts de la literatura.

TAULA 1: Nivells dels principals compostos nitrogenats en mosts.

La quantitat exacta de cadascuna d’aquestes famílies de compostos nitrogenats varia àmpliament en comparar mosts i vins obtinguts provinents de diferents varietats de raïm, de diferents regions, i fins i tot dins de la mateixa regió segons els tractaments que s’hagin pogut aplicar a la vinya. Així, en literatura es pot trobar que el contingut total de nitrogen varia entre 402.400 mg N/L. De la mateixa manera, els valors per al contingut en amoni oscil·len entre 19.250 mg N/L i per al contingut en aminoàcids entre 28.336 mg N/L. A més, el perfil individual d’aminoàcids és extremadament variable entre les diferents varietats de raïm i les diferents regions, encara que en general es pot dir que el més abundant és la prolina i, a continuació, l’arginina, l’alanina, el glutamat, la glutamina, la serina i la treonina, en un ordre que pot patir modificacions entre les diferents fonts consultades.

Dins dels molts factors que influeixen en la variabilitat trobada en analitzar el contingut en compostos nitrogenats, els més importants són: la varietat de raïm, el portaempelt, el nivell de maduresa del raïm al moment de la collita, el tipus de sòl, el clima, la utilització o no de compostos nitrogenats com a fertilitzants a la vinya i la presència d’infeccions de tipus fúngiques. No menys importants són els diversos tractaments a què se sotmet el raïm per a l’obtenció del most i que poden modificar en forma directa o indirecta (a través de la proliferació de microorganismes) els nivells de nitrogen analitzats: el premsat, els tractaments enzimàtics, la clarificació, la filtració, els tractaments amb bentonita, els tractaments tèrmics, per nomenar-ne alguns.

La importància de conèixer el nivell de compostos nitrogenats presents al most rau fonamentalment en la influència directa que tenen en la cinètica de fermentació. Les fermentacions lentes i les aturades sobtades de fermentació se solen associar a l’existència de dèficits en el contingut de nitrogen del most. Això és degut al rol essencial d’aquests compostos en el metabolisme i el creixement dels llevats: sense nitrogen no es poden construir els blocs fonamentals per al creixement d’un organisme viu. A més, els compostos nitrogenats són un factor clau en els mecanismes de formació dels precursors aromàtics que dotaran després el vi de la seva aroma i olor.

De manera usual, el raïm se sol collir tenint en compte paràmetres de maduresa tecnològica i/o fenòlica, que no solen coincidir amb els nivells òptims de nitrogen per a una fermentació adequada. Per això, se sol recórrer a la utilització de suplements nitrogenats, que si bé alteren la composició inicial del most, faciliten el creixement òptim dels llevats. Si bé hi ha diverses fonts i productes comercials sobre la base de nitrogen utilitzables al celler, el fosfat diamònic és el compost d’ús més estès per a aquest fi a causa de temes de cost, facilitat de maneig i rapidesa d’assimilació per part dels llevats. No obstant això, en alguns casos també cal suplementar el most utilitzant fonts de tipus orgànic que ens assegurin la provisió de compostos essencials com aminoàcids i vitamines. Finalment, la utilització d’urea està prohibida a diversos països a causa de la seva implicació en la formació de carbamat d’etil al vi, un compost sospitós de tenir activitat carcinogènica.

Sumat a tot el que s’ha dit anteriorment, cal tenir en compte que no totes les fonts de nitrogen són accessibles d’igual manera pel llevat i fins i tot, algunes, no ho són en absolut. Perquè el llevat pugui fer ús dels compostos nitrogenats cal que entrin a la cèl·lula a través d’algun tipus de mecanisme de transport. Per aquesta raó, les formes nitrogenades preferides pels llevats corresponen a dos grups: els aminoàcids primaris (que representen la fracció orgànica del N) i les sals de l’ió amoni (que representen la fracció inorgànica del N). La prolina, l’aminoàcid més abundant als mosts, no és assimilable pels llevats pel fet que és un aminoàcid secundari.

La suma d’ambdues fraccions utilitzables constitueix el que s’anomena el nitrogen fàcilment assimilable (NFA), també conegut com a nitrogen assimilable pels llevats (YAN, per les sigles en anglès). L’NFA determinat al raïm és un valor indicatiu de poca utilitat pràctica, perquè la majoria dels compostos nitrogenats són a la pell i per passar al most hi ha d’haver algun tipus de contacte entre ells. Per aquesta raó, és indispensable determinar l’NFA al most abans de començar la fermentació per determinar si cal realitzar algun tipus de suplementació. Els mosts amb nivells inicials de NFA inferiors a 150 mg N/L solen donar lloc a fermentacions molt lentes amb baixa població de llevats. D’altra banda, nivells excessivament elevats de NFA condueixen a poblacions de dures dures anormalment altes, la qual cosa genera una temperatura de fermentació més gran i una major producció d’acidesa volàtil, a més del risc de producció d’amines biògenes. A més, alts nivells de NFA també poden afavorir el desenvolupament de microorganismes no beneficiosos a causa de la major disponibilitat de nutrients. Addicionalment al control inicial, caldrà mantenir una vigilància dels nivells de NFA al llarg de tot el procés fermentatiu com a eina de control per evitar parades indesitjades i per determinar si cal realitzar suplementacions addicionals.

Per tot allò detallat, el seguiment del valor de NFA es torna en un element indiscutible per al control del procés i l’obtenció de vins d’alta qualitat i preu. A continuació, es repassaran les tècniques existents per a la determinació dels nivells de nitrogen en mosts i vins, dacord amb dos grans tipus danàlisis basats en la determinació del nitrogen total o del fàcil ment assimilable.

Mètodes de determinació del contingut total de nitrogen

Aquest tipus de mètodes es troben oficialitzats per l’Organització Internacional de la Vinya i el Vi (OIV) al Compendi Internacional de Mètodes d’Anàlisi. Allà es recullen dos tipus de mètodes per a la determinació quantitativa del contingut de nitrogen total.

El primer (OIVMAAS32302A) es basa en el principi químic del mètode de Dumas. En un primer moment, la mostra és sotmesa a una combustió total en atmosfera d’oxigen. Després, els gasos generats durant la combustió es redueixen utilitzant coure i es procedeix a dessecar-los i eliminar el diòxid de carboni present en ells. Finalment, el nitrogen gasós és detectat utilitzant un cataròmetre.

El segon tipus de mètode (OIVMAAS32302B) es basa en el principi químic del mètode de Kjeldahl. En aquest procediment, la mostra es digereix en primer lloc utilitzant àcid sulfúric en presència d’un catalitzador específic (barreja de sulfat cúpric i potàssic). Posteriorment, en una segona etapa, se sotmet el producte de la digestió a una destil·lació al mig alcalí. D’aquesta manera, l’amoníac generat es recull en el destil·lat per després ser determinat per valoració utilitzant amb aquesta finalitat una solució d’àcid clorhídric 0,1M.

El principal desavantatge d’aquest tipus de mètodes, a més de com són de laboriós, és que tots dos determinen el contingut total de nitrogen i per tant valoren en excés el nitrogen que realment està disponible a nivell biològic per als llevats.

Mètodes de determinació del nitrogen fàcilment assimilable (NFA)

Hi ha diversos mètodes per determinar l’NFA, és a dir, la suma del contingut en ion amoni i en aminoàcids primaris d’una mostra de most o vi. Alguns d’aquests mètodes fan la determinació conjunta mentre que altres fan una determinació per separat de cadascuna de les fraccions en consideració. Si es recorda la definició de l’NFA, es podia representar com la suma d’una contribució d’origen orgànic (aminoàcids primaris lliure, coneguts com a PAN o FAN per les sigles en anglès) i una altra d’origen inorgànic (ió amoni). Cadascuna daquestes fraccions compta amb mètodes de determinació específic. Es repassa cadascuna de les opcions a continuació.

Mètode de Soresen per a la determinació conjunta de l’NFA: En aquest mètode, per tal de bloquejar els ions amoni i els grups amino dels aminoàcids presents la mostra és inicialment tractada amb una solució de formaldehid (també anomenat formol). D’aquesta manera, es deixen lliures els contraions àcids de les sals d’amoni i els respectius grups carboxil dels aminoàcids.

En conseqüència, el pH de la mostra disminueix i l’acidesa resultant es pot determinar mitjançant valoració amb solució d’hidròxid de sodi 0,1M. És important tenir en compte que, tant la mostra com la solució de formaldehid, han d’estar prèviament ajustades a un pH igual a 8 per poder fer una determinació precisa i sense interferències.

El diòxid de sofre, habitualment present a les mostres de vins i mosts, pot alterar el resultat obtingut degut a la seva funció àcida, particularment si les dosis són molt altes. Aquesta interferència es pot evitar fent una defecació prèvia de la mostra amb solució de clorur de bari.

Si bé aquesta valoració no té en compte el contingut de prolina entre els aminoàcids que es determinen, hi ha diversos compostos que poden arribar a interferir en la determinació i, per tant, solen obtenir valors en excés respecte als altres mètodes de determinació de l’NFA.

Durant anys, el mètode Sorensen va ser la manera habitual de determinar l’NFA en mosts i vins. Tot i això, la complexitat de la tècnica, que necessita certa habilitat manual de l’operador, sumada a les condicions especials necessàries per treballar amb un compost tòxic com el formaldehid, han portat a la pràctica desaparició d’aquesta tècnica dels laboratoris enològics.

Mètodes per a la determinació de l’ió amoni: Val a dir que l’OIV compta amb un mètode oficial per a la determinació de l’ió amoni (OIVMAAS32201) basat en la fixació de l’analit d’interès a través de l’ús d’una resina d’intercanvi iònic per a la posterior elució, destil·lació i valoració final amb una solució d’àcid clorhídric. No obstant això, a la pràctica és un mètode massa complicat i laboriós per ser utilitzat rutinàriament. És per això que amb el transcurs del temps van sorgir diverses alternatives. Algunes, com la determinació mitjançant elèctrodes d’ions selectius, també van demostrar que són poc pràctiques. D’altra banda, la determinació enzimàtica de l’ió amoni ha provat amb escreix ser la millor i més eficient tècnica per al mesurament del contingut d’amoni en mostres de vi i mosts.

El principi químic de la tècnica enzimàtica es basa en la determinació selectiva i específica de l’ió amoni a través de la seva reacció amb l’ió 2oxoglutarat en presència de l’enzim glutamat deshidrogenasa i del cofactor ADPH, com es mostra a la Figura 1.

FIGURA 1: Esquema de la reacció de determinació enzimàtica de l’ió amoni.

Aprofitant les característiques d’absorbància del cofactor NADPH, és possible fer un seguiment espectrofotomètric d’aquesta reacció mitjançant la lectura de l’absorbància de la mescla a 340 nm.

La utilització de patrons de concentració coneguda per efectuar el calibratge seguint la llei de Lambert Beer, la utilització de reactius líquids i estables a llarg termini com els subministrats per TDI i l’aparició ja fa un temps dels analitzadors químics automàtics, dels quals la gamma Miura és el seu major exponent, faciliten a l’operador totes les tasques de maneig de reactius, calibratge i càlcul de les concentracions a determinar a les mostres incògnites.

Mètodes per a la determinació dels aminoàcids primaris: Hi ha diversos mètodes químics utilitzats en la derivatització d’aminoàcids per a la seva determinació conjunta per espectrofotometria UVVis o per a la seva determinació individual a través de mètodes de separació com ara la cromatografia de líquids (HPLC). Entre els compostos químics capaços de reaccionar amb els aminoàcids i, per tant, de ser útils per a la seva determinació, es poden anomenar: la ninhidrina, l’oftalaldehid (OPA), el fenilisotiocianat, l’àcid 2,4,6trinitrobencenosulfònic, el clorur de dansil, entre d’altres.

A nivell pràctic per als cellers, la possibilitat de comptar amb equips d’HPLC i d’esperar els llargs temps d’anàlisi que són necessaris per a cada mostra limita l’aplicabilitat d’aquesta tècnica de manera rutinària, limitant-la només a activitats de recerca.

D’altra banda, la utilització i varietat d’analitzadors químics automàtics disponibles al mercat, com es pot veure a la Figura 4 que presenta la gamma completa d’analitzadors Miura, ha permès estendre l’ús de l’espectrofotometria UVVis a laboratoris de cellers de totes les mides.

Pel que fa a aquesta tècnica, cal dir que el seu desenvolupament va començar el 1998 a la Universitat de Califòrnia a Davis (Estats Units) a causa del treball de Christian Butzke sobre un mètode per a la determinació dels aminoàcids primaris consistent en la derivatització d’aquests amb un reactiu d’oftalaldehid i N-acetil-L-cisteïna, com es mostra a la Figura 2.

FIGURA 2: Esquema de la reacció de determinació colorimètrica dels aminoàcids primaris.

Aquest reactiu és capaç de formar un derivat de tipus isoindol amb cadascun dels aminoàcids d’interès i es pot determinar fàcilment a través del mesurament de l’absorbància de la barreja a 340 nm. En el treball inicial, però, l’estabilitat dels reactius de determinació amb prou feines arribava a un parell de setmanes. Actualment, els reactius desenvolupats i comercialitzats per TDI presenten una alta estabilitat (18 mesos) mantenint i fins i tot millorant les prestacions analítiques, gràcies a l’ús de primeres matèries d’alta qualitat i de patrons estables de concentració coneguda. Daquesta manera, es facilita la determinació de la fracció orgànica de lNFA.

Conclusió

L’avenç tecnològic en la construcció i disseny dels analitzadors químics automàtics, sumat a la investigació i desenvolupament en la producció de reactius químics enzimàtics i colorimètrics més estables, permeten avui dia als cellers poder disposar de valors de NFA fiables i en poc temps , sense haver de recórrer a metòdiques tedioses, treballoses i de resultats la practicitat dels quals queda en dubte.

D’aquesta manera, TDI aposta per la simplificació del treball i la facilitat en l’ús de les tècniques analítiques més modernes, permetent alliberar el temps de l’operador per a altres tasques, evitant la complexitat del maneig de substàncies tòxiques i/o perilloses i contribuint a facilitar la tasca diària de l’enòleg, que només cal responsabilitzar-se de prendre les decisions adequades per obtenir el millor dels vins.

Si teniu una necessitat analítica i voleu saber com resoldre-la, no dubteu a comunicar-vos amb nosaltres via c/e (info@t­-d­-i.es), a través d’aquesta mateixa web www.tdianaliza­dores.com o de les nostres xarxes socials, i junts podrem trobar la millor solució.

FIGURA 3: Kits per a la determinació enzimàtica del Nitrogen Amoniacal i la determinació colorimètrica del Nitrogen αAmínic.

FIGURA 4: Gamma MIURA d’analitzadors químics automàtics, marca exclusiva de TDI (Micro, 200, 200 2 braços i One).