FOTO: Gotim de raïm Riesling afectat per Botrytis.

Introducció

Després d’un llarg període que va des de la brotada fins a la maduració, arriba el moment de la verema i de portar els raïms al celler. Ja a la recepció, els encarregats analitzaran els paràmetres necessaris per determinar la maduresa tecnològica i fenòlica del raïm i el seu estat sanitari. Una bona matèria primera de partida assegura una alta qualitat del producte final, la qual cosa permet tenir més competitivitat i millors preus en un context altament desafiant tant a nivell nacional com internacional.

Actualment, el nivell de contaminació per Botrytis és el criteri determinant per avaluar la qualitat sanitària de la matèria primera. Segons estudis, aquesta infecció generada pel fong B. cinerea, pot produir un 60-70% de minvament en el rendiment de la vinya i pèrdues que freguen els 1.000 milions de dòlars a tota la cadena vitivinícola. Hi ha dos períodes de risc on la vinya és més susceptible a la infecció. El primer és durant la floració, quan les parts més susceptibles de la flor són atacades pel patogen que ha sobreviscut a l’hivern a la vinya en estructures momificades. El segon període és durant la maduració, quan a causa dels processos fisicoquímics que es produeixen dins del raïm i que modifiquen la composició del mateix, la pell es torna més sensible a infeccions externes i es donen també les condicions necessàries perquè es reprengui la infecció que es trobava en estat latent des de la floració. Les condicions que maximitzen el risc d’infecció són: climes càlids (18-30 °C), alta humitat, poca circulació d’aire, infeccions prèvies a la vinya, fullatge molt dens, i la susceptibilitat pròpia de cada varietat de raïm a la infecció.

Evolució històrica de la determinació del nivell d’infecció

Històricament, la Botrytis es determinava per simple inspecció visual, quan el fong ja es trobava en una fase avançada de desenvolupament extern i el raïm havia vist afectada la seva qualitat de manera parcial. L’objectivitat i la mida de mostra necessària per a una determinació precisa del nivell d’infecció eren punts forts en contra d’aquesta modalitat.

Gràcies a l’avenç en l’estudi del metabolisme de la malaltia, el 1973 es va publicar la primera descripció de l’enzim lacasa de B. cinerea. Aquest enzim, secretat per diverses famílies de fongs, facilita l’oxidació dels compostos fenòlics del raïm generant productes que modifiquen el color dels vins. Per mesurar l’activitat enzimàtica de la lacasa es van desenvolupar dos tipus de mètodes: polarogràfics i colorimètrics.

Cap al 1983, un equip d’investigadors de l’Escola Nacional d’Agricultura de Montpeller juntament amb experts de TDF-TDI van desenvolupar el Technolyseur 2000. Aquest analitzador mesurava la velocitat de consum d’oxigen per l’activitat de la lacasa, fent servir tècniques de polarografia. Una mostra de most sense filtrar es barrejava amb un reactiu que contenia substrat fenòlic específic i un inhibidor de tirosinasa, un enzim també present al raïm i que interfereix en la determinació. Els resultats es podien obtenir en 3-4 minuts. Tot i això, l’equip no tenia la robustesa necessària per treballar a recepció i tenia molt poca sensibilitat. Cap a finals d’aquella mateixa dècada, es va començar a comercialitzar amb el nom de Raisytis©.

IMATGE: Mètodes polarogràfics per determinar lacasa Esquerra: esquema del Technolyseur. Dreta: imatge del Raisitys©.

Els mètodes colorimètrics per a la determinació de l’activitat de lacasa van començar a investigar-se el 1974. Tot i això, no va ser fins al 1984 que un grup d’investigadors de la Universitat de Bordeus va desenvolupar un procediment basat en l’ús de la siringaldazina, substrat fenòlic específic i estable a l’oxidació. En presència de la lacasa, la siringaldazina s’oxida generant una quinona de color rosat que es pot quantificar per espectrofotometria.


FOTO: Mètodes colorimètrics per determinar lacasa. Esquerra: Botrytest©. Dreta: imatge del Botrymat©.

Si bé, la sensibilitat del mètode és 10 vegades superior al polarogràfic, es requeria un pretractament del most per eliminar compostos fenòlics i el sulfit present. Aquest mètode donava resultats en 10 minuts si es feien servir tècniques manuals. Entre finals de la dècada de 1980 i inicis de 1990, van sorgir reactius d’ús immediat (Botrytest©, Botrykit©) i analitzadors automàtics (Botrymat©) de la firma BioSerae, amb els quals el temps d’anàlisi es reduïa a 2 minuts.

FOTO: Glucònic Xpress, un desenvolupament exclusiu de TDI, per brindar els resultats més precisos i ràpids del mercat.

Al 1995, TDI comença a promoure la utilització de l’àcid glucònic present al raïm com a paràmetre de qualitat. Mitjançant l’enzim glucosa oxidasa, B. cinerea converteix la glucosa present al raïm en àcid glucònic. Encara que aquest metabòlit no presenta una relació lineal amb el grau de desenvolupament del fong, sí que es poden identificar dues etapes: una primera etapa de desenvolupament del fong en la qual l’àcid glucònic és utilitzat per al creixement de l’organisme, i una fase de desenvolupament extern del fong fong on comença a acumular-se el metabòlit. La detecció del nivell d’àcid glucònic es pot fer per diversos mètodes.

Els mètodes enzimàtics permeten la determinació de l’analit a través de l’ús de reactius que contenen enzims específics i selectius. La reacció química es pot monitoritzar per espectrofotometria visible. L’aparició al mercat dels analitzadors automàtics va dotar aquests mètodes summament fiables de la rapidesa necessària a recepció, si bé els temps de determinació estan al voltant dels 10 minuts. Fruit del treball desenvolupat a TDI en l’optimització dels reactius i les tècniques de mesura, es van poder rebaixar els temps d’anàlisi a 3-4 minuts, amb una imprecisió als resultats de ±50 mg/L de glucònic.

Al voltant de l’any 2000 arriben al mercat mètodes basats en espectroscopia infraroja (FTIR), que utilitzen la interacció existent entre la radiació i la mostra, en conjunt amb potents tècniques de quimiometria. Tot i que la imprecisió en els resultats és de ±150 mg/L de glucònic, el seu principal avantatge és el temps d’anàlisi: 90 segons, incloent-hi filtratge de la mostra. L’experiència ha demostrat que per poder utilitzar correctament aquesta tècnica cal mesurar el glucònic de manera directa amb la seva pròpia base de dades, el més àmplia possible i que s’actualitzi campanya a campanya, per poder tenir un bon calibratge i ajustament del mètode.

Des del 2010, es comercialitzen biosensors que permeten detectar l’àcid glucònic, combinant un enzim específic amb el mesurament amperomètric de la reacció. Aquests equips fan servir un biotest, amb l’enzim immobilitzat. Cada biotest conté 50 o 100 determinacions i requereix una hidratació prèvia de 12 hores i un calibratge a l’inici del seu ús. La imprecisió és de ±100 mg/L, amb temps d’anàlisi de 5 minuts i un cost relativament elevat.

Finalment, en anys recents, s’han desenvolupat tests per determinar el nombre d’unitats del patogen al raïm, utilitzant una tècnica de diagnòstic molecular anomenada PCR. Aquesta tècnica, altament específica i tristament famosa per la recent pandèmia de CoViD-19, reemplaça el control biològic tradicional per rapidesa, però el cost i la velocitat d’anàlisi la fa impossible de practicar a recepció.

Efectes sobre la composició i treballs del most

Tota la literatura, si bé de vegades és contradictòria, permet assegurar que la Botrytis produeix severs efectes de modificació de la composició química del raïm i, en conseqüència, del most que se n’obté.

Com ja s’ha exposat anteriorment, un dels metabòlits principals de l’activitat del patogen és l’àcid glucònic. El glucònic pot ser produït tant per B. cineria, com pels bacteris i fongs responsables de la podridura àcida. Això fa que els nivells de glucònic puguin ser indicadors del nivell d’infecció per Botrytis i per altres microorganismes. A nivell mundial, l’Organització Internacional del Vi i la Vinya recomana nivells de glucònic present en most inferiors a 1 g/L. No obstant això, tant a Castella-la Manxa com a la D.O. Cava, es redueix aquest límit a 0,6 g/L; mentre que a Austràlia els nivells considerats òptims són els menors de 0,3 g/L. Si bé és un gran indicador de Botrytis, l’àcid glucònic no té més efectes en el processament del most, encara que en concentracions elevades en pot afectar el sabor.

Un altre metabòlit produït en etapes primerenques de la infecció per Botrytis és el glicerol. La concentració pot arribar a l’ordre de 5-7 g/L i es manté aproximadament sense canvis. Si tenim en compte que el nivell d’àcid glucònic augmenta amb el desenvolupament de la infecció, la relació glicerol/glucònic serà un indicador important de l’edat de la malaltia. Com més petita sigui, més avançada estarà la infecció.

Com es va nomenar anteriorment, la lacasa és un exoenzim produït per B. cinerea, la principal acció de la qual és l’oxidació dels compostos fenòlics presents en el most la qual cosa porta a l’alteració del color del vi per pardejament. Aquest enzim és resistent a l’alcohol i insensible al tractament amb sulfits, encara que poden servir com a mesura preventiva per eliminar l’oxigen intervinent en la producció de les reaccions indesitjables. També els tanins ecològics han mostrat acció davant de la lacasa. Tot i això, la seva eliminació per clarificació amb bentonita no ha demostrat ser eficaç. L’únic tractament que assegura l’eliminació de la lacasa és la termovinificació utilitzant temperatures de l’ordre de 75 °C durant almenys 2 minuts.

Un efecte important de la presència de Botrytis és el consum de sucres necessaris per al metabolisme del fong. Així, s’observa una reducció del nivell de sucres disponibles per a la fermentació, principalment de glucosa, cosa que eleva la relació fructosa/glucosa. Aquest paràmetre és particularment important a l’hora d’escollir els ceps adequats que es faran servir per tirar endavant el procés fermentatiu.

El contingut d’àcids totals en un most afectat per Botrytis es veu reduït, principalment per la disminució de la quantitat d’àcid màlic i àcid tartàric, i pot arribar a ser de fins al 50-70%. Aquesta baixa de l’acidesa total produeix un augment concomitant del pH, augmentant així el risc microbiològic per contaminació amb bacteris acètics i làctics. Un altre efecte del metabolisme és l’augment en la producció d’àcid pirúvic i 2-cetoglutàric, compostos altament influents en el moment de calcular l’addició de sulfits, pel poder de combinació amb el diòxid de sofre (s’estima que l’efecte de combinat de tots dos àcids podria ser responsable de fins a un 40% del sulfit combinat present al most).

El patogen, a causa del seu propi metabolisme, requereix nutrients, els quals pren del most. Això provocarà una reducció del nitrogen fàcilment assimilable pels llevats, en particular d’aminoàcids (entre un 6-70%). A més, en forma particular, es redueixen les quantitats de vitamines B1 (tiamina) i B6 (piridoxina), factors de desenvolupament fonamentals per als llevats. Per tant, per tenir una velocitat de fermentació adequada es requerirà la complementació amb fonts de nitrogen orgàniques i tiamina, juntament amb la selecció de ceps resistents i amb menys requeriment nutricional.

Una de les principals conseqüències de la Botrytis sobre la processabilitat del most, és la producció de polisacàrids, pertanyents a dos grans grups. El primer grup són els polímers de mannosa i galactosa, que per inhibició dels llevats condueixen a un augment dels nivells d’acètic i glicerol durant la fermentació. El segon grup, més important per les seves conseqüències pràctiques, són els polímers de glucosa anomenats glucans. Aquestes molècules d’alt pes molecular augmenten la viscositat del most i generen problemes als filtres a causa de la seva acció colmatant i de la baixa solubilitat que presenten en solucions alcohòliques. La seva presència al most es pot determinar a través d’una senzilla prova, complementària a la determinació de l’índex de colmatació.

Una característica negativa dels vins elaborats amb raïms afectats per Botrytis és l’aparició d’aromes a fong i terra, deguts a la producció de compostos com a sotoló i 1-octen-3-ol.

En vins blancs, s’ha associat la formació de precipitats de mucat càlcic després de l’embotellament, a la producció d’àcid múcic en nivells superiors a 0,1 g/l durant el procés d’infecció del fong.

Un problema important per als productors de vi base d’escumants i cava és la secreció de proteases al medi per part del fong. Aquests enzims degraden les proteïnes i, estudis recents, han demostrat que pot afectar la formació i l’estabilitat de l’escuma a la copa.

També es pot enumerar com a inconvenient, la producció de compostos antibiòtics per part del fong, fonamentalment la botricina, que actua com a inhibidor del creixement dels llevats.

Finalment, no s’ha de deixar de nomenar que la Botrytis pot actuar com a porta d’entrada per a un altre tipus de microorganismes com gluconobacteris i acetobacteris, que generaran nivells creixents de glicerol i àcid acètic al most, proporcionant qualitats negatives al vi que s’obtindrà.

Conclusions

L’estudi i caracterització dels canvis fisicoquímics produïts al most per la infecció amb Botrytis ha permès tenir eines disponibles per tirar endavant la vinificació del most per obtenir un producte de la més alta qualitat possible. Aquestes eines són avui a disposició dels tècnics i enòlegs.

Tot i això, per poder utilitzar aquestes eines, cal disposar d’informació precisa i adequada, per tal de prendre les precaucions i accions correctives necessàries.

L’única manera d’estar informats adequadament és a través de l’analítica en el moment de la recepció al celler. Un pla analític complet hauria de tenir en compte la determinació de paràmetres fonamentals com àcid glucònic, glicerol, àcid acètic, nitrogen amoniacal, nitrogens alfa-amínic, glucans, índex de colmatació i control microbiològic.

Per a la majoria d’aquests paràmetres, Tecnología Difusión Ibérica S.L. ofereix les solucions més innovadores i modernes ia mida de les vostres necessitats i possibilitats.