FOTO: Racimo de uvas Riesling afectado por Botrytis.

Introducción

Luego de un extenso período que va desde la brotación hasta la maduración, llega el momento de la vendimia y de llevar los racimos a la bodega. Ya en la recepción, los encargados analizarán los parámetros necesarios para determinar la madurez tecnológica y fenólica de la uva y su estado sanitario. Una buena materia prima de partida asegura una alta calidad del producto final, lo cual permite tener mayor competitividad y mejores precios en un contexto altamente desafiante tanto a nivel nacional como internacional.

Actualmente, el nivel de contaminación por Botrytis es el criterio determinante para evaluar la calidad sanitaria de la materia prima. Según estudios, esta infección generada por el hongo B. cinerea, puede producir un 60-70% de merma en el rendimiento de la viña y pérdidas que rozan los 1.000 millones de dólares en toda la cadena vitivinícola. Existen dos períodos de riesgo donde la viña es más susceptible a la infección. El primero es durante la floración, cuando las partes más susceptibles de la flor son atacadas por el patógeno que ha sobrevivido al invierno en la viña en estructuras momificadas. El segundo período es durante la maduración, cuando debido a los procesos físico-químicos que se producen dentro de la uva y que modifican la composición de la misma, la piel se vuelve más sensible a infecciones externas y se dan también las condiciones necesarias para que se reanude la infección que se encontraba en estado latente desde la floración. Las condiciones que maximizan el riesgo de infección son: climas cálidos (18-30 °C), alta humedad, poca circulación de aire, infecciones previas en la viña, follaje muy denso, y la susceptibilidad propia de cada variedad de uva a la infección.

Evolución histórica de la determinación del nivel de infección

Históricamente, la Botrytis se determinaba por simple inspección visual, cuando el hongo ya se encontraba en una fase avanzada de desarrollo externo y la uva había visto afectada su calidad de manera parcial. La objetividad y el tamaño de muestra necesario para una determinación precisa del nivel de infección eran fuertes puntos en contra de esta modalidad.

Gracias al avance en el estudio del metabolismo de la enfermedad, en 1973 se publicó la primera descripción de la enzima lacasa de B. cinerea. Esta enzima, secretada por diversas familias de hongos, facilita la oxidación de los compuestos fenólicos de la uva generando productos que modifican el color de los vinos. Para medir la actividad enzimática de la lacasa se desarrollaron dos tipos de métodos: polarográficos y colorimétricos.

Hacia 1983, un equipo de investigadores de la Escuela Nacional de Agricultura de Montpellier junto a expertos de TDF-TDI desarrollaron el Technolyseur 2000. Este analizador medía la velocidad de consumo de oxígeno por la actividad de la lacasa, usando técnicas de polarografía. Una muestra de mosto sin filtrar se mezclaba con un reactivo que contenía sustrato fenólico específico y un inhibidor de tirosinasa, una enzima también presente en la uva y que interfiere en la determinación. Los resultados podían obtenerse en 3-4 minutos. Sin embargo, el equipo carecía de la robustez necesaria para trabajar en recepción y tenía muy poca sensibilidad. Hacia finales de esa misma década, comenzó a comercializarse bajo el nombre de Raisytis©.

IMAGEN: Métodos polarográficos para determinar lacasa. Izquierda: esquema del Technolyseur. Derecha: imagen del Raisitys©.

Los métodos colorimétricos para la determinación de la actividad de lacasa comenzaron a investigarse en 1974. Sin embargo, no fue hasta 1984 que un grupo de investigadores de la Universidad de Burdeos desarrolló un procedimiento basado en el uso de la siringaldazina, sustrato fenólico específico y estable a la oxidación. En presencia de la lacasa, la siringaldazina se oxida generando una quinona de color rosado que puede cuantificarse por espectrofotometría.


FOTO: Métodos colorimétricos para determinar lacasa. Izquierda: Botrytest©. Derecha: imagen del Botrymat©.

Si bien, la sensibilidad del método es 10 veces superior al polarográfico, se requería un pretratamiento del mosto para eliminar compuestos fenólicos y el sulfito presente. Este método daba resultados en 10 minutos si se usaban técnicas manuales. Entre finales de la década de 1980 e inicios de 1990, surgieron reactivos pronto al uso (Botrytest©, Botrykit©) y analizadores automáticos (Botrymat©) de la firma BioSerae, con los cuales el tiempo de análisis se reducía a 2 minutos.

FOTO: Glucónico Xpress, un desarrollo exclusivo de TDI, para brindar los resultados más precisos y rápidos del mercado.

En 1995, TDI comienza a promover la utilización del ácido glucónico presente en la uva como parámetro de calidad. Mediante la enzima glucosa oxidasa, B. cinerea convierte la glucosa presente en la uva en ácido glucónico. Aunque este metabolito no presenta una relación lineal con el grado de desarrollo del hongo, sí pueden identificarse dos etapas: una primera etapa de desarrollo del hongo en la cual el ácido glucónico es utilizado para el crecimiento del organismo, y una fase de desarrollo externo del hongo donde comienza a acumularse el metabolito. La detección del nivel de ácido glucónico se puede llevar a cabo por diversos métodos.

Los métodos enzimáticos permiten la determinación del analito a través del empleo de reactivos que contienen enzimas específicas y selectivas. La reacción química puede monitorizarse por espectrofotometría visible. La aparición en el mercado de los analizadores automáticos dotó a estos métodos sumamente fiables de la rapidez necesaria en recepción, si bien los tiempos de determinación rondan los 10 minutos. Fruto del trabajo llevado a cabo en TDI en la optimización de los reactivos y las técnicas de medida, se pudieron rebajar los tiempos de análisis a 3-4 minutos, con una imprecisión en los resultados de ±50 mg/L de glucónico.

Sobre el año 2000, llegan al mercado métodos basados en espectroscopía infrarroja (FTIR), que utilizan la interacción existente entre la radiación y la muestra, en conjunto con potentes técnicas de quimiometría. Aunque la imprecisión en los resultados es de ±150 mg/L de glucónico, su principal ventaja es el tiempo de análsis: 90 segundos, incluyendo filtrado de la muestra. La experiencia ha demostrado que para poder utilizar correctamente esta técnica es necesario medir el glucónico de manera directa con su propia base de datos, lo más amplia posible y que se actualice campaña a campaña, para poder tener una buena calibración y ajuste del método.

Desde 2010, se comercializan biosensores que permiten detectar el ácido glucónico, combinando una enzima específica con la medición amperométrica de la reacción. Estos equipos emplean un biotest, con la enzima inmovilizada. Cada biotest contiene 50 o 100 determinaciones y requiere una hidratación previa de 12 horas y una calibración al inicio de su uso. La imprecisión es de ±100 mg/L, con tiempos de análisis de 5 minutos y un coste relativamente elevado.

Finalmente, en años recientes, se han desarrollado tests para la determinación del número de unidades del patógeno en la uva, utilizando una técnica de diagnóstico molecular denominada PCR. Esta técnica, altamente específica y tristemente famosa por la reciente pandemia de CoViD-19, reemplaza al control biológico tradicional por rapidez, pero su costo y velocidad de análisis la hace imposible de practicar en recepción.

Efectos sobre la composición y trabajos del mosto

Toda la literatura, si bien a veces es contradictoria, permite asegurar que la Botrytis produce severos efectos de modificación de la composición química de la uva y, en consecuencia, del mosto que se obtiene de ella.

Como ya se ha expuesto anteriormente, uno de los principales metabolitos de la actividad del patógeno es el ácido glucónico. El glucónico puede ser producido tanto por B. cinérea, como por las bacterias y hongos responsables de la podredumbre ácida. Esto hace que los niveles de glucónico puedan ser indicador del nivel de infección por Botrytis y por otros microorganismos. A nivel mundial, la Organización Internacional del Vino y la Viña, recomienda niveles de glucónico presente en mosto inferiores a 1 g/L. Sin embargo, tanto en Castilla La Mancha como en la D.O. Cava, se reduce este límite a a 0,6 g/L; mientras que en Australia los niveles considerados óptimos son los menores a 0,3 g/L. Si bien es un gran indicador de Botrytis, el ácido glucónico no tiene mayores efectos en el procesamiento del mosto, aunque en concentraciones elevadas puede afectar su sabor.

Otro metabolito producido en etapas tempranas de la infección por Botrytis es el glicerol. Su concentración puede arribar al orden de 5-7 g/L y se mantiene aproximadamente sin cambios. Si tenemos en cuenta que el nivel de ácido glucónico aumenta con el desarrollo de la infección, la relación glicerol/glucónico será un importante indicador de la edad de la enfermedad. Cuanto menor sea, más avanzada estará la infección.

Como se nombró anteriormente, la lacasa es una exoenzima producida por B. cinerea, cuya principal acción es la oxidación de los compuestos fenólicos presentes en el mosto lo cual lleva a la alteración del color del vino por pardeamiento. Esta enzima es resistente al alcohol e insensible al tratamiento con sulfitos, aunque éstos pueden servir como medida preventiva para eliminar el oxígeno interviniente en la producción de las reacciones indeseables. También los taninos ecológicos han mostrado acción frente a la lacasa. Sin embargo, su eliminación por clarificación con bentonita no ha demostrado ser eficaz. El único tratamiento que asegura la eliminación de la lacasa es la termovinificación, utilizando temperaturas del orden de 75 °C durante al menos 2 minutos.

Un efecto importante de la presencia de Botrytis es el consumo de azúcares necesarios para el metabolismo del hongo. Así, se observa una reducción del nivel de azúcares disponibles para la fermentación, principalmente de glucosa, lo cual eleva la relación fructosa/glucosa. Este parámetro es particularmente importante a la hora de elegir las cepas apropiadas que se utilizarán para llevar adelante el proceso fermentativo.

El contenido de ácidos totales en un mosto afectado por Botrytis se ve reducido, principalmente por la disminución de la cantidad de ácido málico y ácido tartárico, pudiendo llegar a ser de hasta el 50-70%. Esta baja de la acidez total, produce un aumento concomitante del pH, aumentando así el riesgo microbiológico por contaminación con bacterias acéticas y lácticas. Otro efecto del metabolismo es el aumento en la producción de ácido pirúvico y 2-cetoglutárico, compuestos altamente influyentes al momento de calcular la adición de sulfitos, por su poder de combinación con el dióxido de azufre (se estima que el efecto de combinado de ambos ácidos podría ser responsable de hasta un 40% del sulfito combinado presente en el mosto).

El patógeno, debido a su propio metabolismo, requiere de nutrientes, los cuales toma del mosto. Esto provocará una reducción del nitrógeno fácilmente asimilable por las levaduras, en particular de aminoácidos (entre un 6-70%). Además, en forma particular, se reducen las cantidades de vitaminas B1 (tiamina) y B6 (piridoxina), factores de desarrollo fundamentales para las levaduras. Por tanto, para tener una velocidad de fermentación adecuada se requerirá la complementación con fuentes de nitrógeno orgánicas y tiamina, junto a la selección de cepas resistentes y con menor requerimiento nutricional.

Una de las principales consecuencias de la Botrytis sobre la procesabilidad del mosto, es la producción de polisacáridos, pertenecientes a dos grandes grupos. El primer grupo, son los polímeros de manosa y galactosa, que por inhibición de las levaduras conducen a un aumento de los niveles de acético y glicerol durante la fermentación. El segundo grupo, más importante por sus consecuencias prácticas, son los polímeros de glucosa denominados glucanos. Estas moléculas de alto peso molecular aumentan la viscosidad del mosto y generan problemas en los filtros debido a su acción colmatante y a la baja solubilidad que presentan en soluciones alcohólicas. Su presencia en el mosto puede determinarse a través de una sencilla prueba, complementaria a la determinación del índice de colmatación.

Una característica negativa de los vinos elaborados con uvas afectadas por Botrytis es la aparición de aromas a hongo y tierra, debidos a la producción de compuestos como sotolón y 1-octen-3-ol.

En vinos blancos, se ha asociado la formación de precipitados de mucato cálcico después del embotellado, a la producción de ácido múcico en niveles superiores a 0,1 g/L durante el proceso de infección del hongo.

Un problema importante para los productores de vino base de espumantes y cava, es la secreción de proteasas al medio por parte del hongo. Estas enzimas degradan las proteínas y, estudios recientes, han demostrado que puede afectar la formación y estabilidad de la espuma en la copa.

También puede enumerarse como inconveniente, la producción de compuestos antibióticos por parte del hongo, fundamentalmente la botricina, que actúa como inhibidor del crecimiento de las levaduras.

Finalmente, no debe dejar de nombrarse que la Botrytis puede actuar como puerta de entrada para otro tipo de microorganismos como gluconobacterias y acetobacterias, que generarán niveles crecientes de glicerol y ácido acético en el mosto, proporcionando cualidades negativas al vino que se obtendrá.

Conclusiones

El estudio y caracterización de los cambios físico-químicos producidos en el mosto por la infección con Botrytis ha permitido tener herramientas disponibles para llevar adelante la vinificación del mosto de manera de obtener un producto de la más alta calidad posible. Estas herramientas están hoy a disposición de los técnicos y enólogos.

Sin embargo, para poder utilizar esas herramientas, es necesario disponer de información precisa y adecuada, a fin de tomar las precauciones y acciones correctivas necesarias.

La única manera de estar informados adecuadamente, es a través de la analítica en el momento de la recepción en bodega. Un plan analítico completo debería tener en cuenta la determinación de parámetros fundamentales como ácido glucónico, glicerol, ácido acético, nitrógeno amoniacal, nitrógenos alfa-amínico, glucanos, índice de colmatación y control microbiológico.

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